抗體偶聯藥物ADC - 連續流合成

研究背景

抗體(ti) 偶聯藥物（ADC，Antibody-drug conjugates），是將類似於(yu) 化療的細胞毒性藥物與(yu) 單克隆抗體(ti) 連接在一起，從(cong) 而實現對腫瘤組織的靶向殺傷(shang) 功能。其結合了靶向療法和化療療法的作用原理，具有靶向性高，特異性強，毒副作用小等優(you) 點。

早在2015年，Jones團隊利用流動化學實現通過小分子標簽加工蛋白質(包括抗體(ti) )的可行性，並成功地利用直接的一步生物偶聯天然賴氨酸側(ce) 鏈，對蛋白質和抗體(ti) 進行修飾。（ 請參考：J. Flow Chem. 2015, 5, 151-154)

但在ADC中，由於(yu) 抗體(ti) 中有超過80個(ge) 暴露的且具備反應活性的賴氨酸殘基。如此多的活性位點會(hui) 使得偶聯反應產(chan) 生多種偶聯混合物。ADC的連續化合成目前未見有報道。

結合之前Jones的工作，研究者決(jue) 定嚐試以連續流反應器合成ADC。

ADC合成概述

通過半胱氨酸等內(nei) 源性氨基酸，在二硫鍵間的連接位點合成ADC是一種常見的方法。這種偶聯方法需要對蛋白質分子進行氧化還原，以釋放活性硫醇部分。

該生物偶聯過程可分為(wei) 兩(liang) 個(ge) 步驟: 通過三（2-羧乙基）膦（TCEP）還原抗體(ti) ，然後巰基與(yu) 馬來酰亞(ya) 胺藥物偶聯（如圖1）。

圖1. 半胱氨酸基ADC的合成方案

這種偶聯技術具有優(you) 勢，因為(wei) 其控製的藥物-抗體(ti) 比（DAR）（典型DAR值在3.5 - 8之間）和相對較低的異質性，目前主要使用傳(chuan) 統的間歇反應器進行合成。

作者使用連續流反應器和傳(chuan) 統的含馬來酰亞(ya) 胺藥物連接劑生產(chan) ADC，開發出一種連續製備9個(ge) 半胱氨酸偶聯ADC的工藝（圖2），在幾分鍾內(nei) 從(cong) 天然抗體(ti) 實現ADC合成，且所得ADC的目標DAR和聚集特性與(yu) 市售ADC相似。

一. 連續流工藝

作者基於(yu) 之前使用連續流反應器的經驗，此次使用的是V型混合器+管式反應器。實驗設計時，除了考量反應時間和溫度，管式反應器的長度也是此次工藝優(you) 化的關(guan) 鍵變量。

圖2. 連續流合成流程圖

管式反應器的長度直接影響反應時間（反應器1用於(yu) TCEP還原，反應器2用於(yu) 藥物偶聯。  因此，作者評估了反應器長度和產(chan) 生的ADC的 DAR之間的關(guan) 係（表1）。

在初步可行性研究中，作者選擇曲妥珠單抗（Trastuzumab）和藥物連接劑MMAE進行偶聯。通過反相高效液相色譜(RP)分析，將間歇反應器和連續流法生產(chan) 的ADC進行了直接比較。

表1. 間歇式反應器和連續化反應結果比對

二. 工藝條件研究

• 在間歇法的生物偶聯中，通常需要超過1小時的時間來完成ADC偶聯步驟。

• 而使用管式反應器，在37℃下進行3min TCEP還原，然後在25℃下偶聯藥物 3min，得到的ADC的測量DAR值為(wei) 3.2（表1，條目1）。

• 當偶聯反應時間降低到1.5 min時，得到的ADC的DA值R沒有變化（表1，條目2）。

• 偶聯時間進一步降低到0.75 min也沒有顯著降低，但將Reactor-2停留時間降低到0.38 min，得到的ADC的DAR值小於(yu) 2。

• 還原步驟（Reactor-1）的時間從(cong) 3min減少到1.5min也導致ADC的DAR值小於(yu) 2。

三. 反應底物的拓展

作者進一步評估了其他抗體(ti) 和藥物連接子，以驗證連續流化學方法合成ADC的普遍性和可靠性。

如表2所示：通過連續流反應器，作者製備9個(ge) 半胱氨酸偶聯ADC，都取得了不錯的結果。

表2. 底物拓展研究實驗